2012-2013

Τεχνική ELISA για μέτρηση πρωτεϊνών :

Μιχαηλίδου Ιφιγένεια

(ifigeneia9@yahoo.gr)

Μποτονάκη Μαρίνα

(mariakokaki@yahoo.gr)
Τούντα Τέρυ
(ttounta@hotmail.com)

Σταύρακας Βασίλης

(bill.scs7@gmail.com)


Ευχαριστίες
Ιδιαίτερες ευχαριστίες δίνονται σε όλους τους φοιτητές του εργαστηρίου «Εμβιομηχανικής και Βιοϊατρικής Τεχνολογίας» και κυρίως στην Έλλη Χατζοπούλου και στο Δημήτρη Μεσσίνη. Η συμβολή τους στην εκπόνηση του παρόντος ήταν πολύτιμη και ανεκτίμητη !




  1. Εισαγωγικά
H ELISA (Enzyme-linkedimmunosorbentassay) είναι μία διαδεδομένη μορφή αναλυτικής βιοχημικής δοκιμής η οποία χρησιμοποιεί ένα υπό-είδος ετερογενούς και στερεάς φάσης ενζυματικής ανοσοανίχνευσης (ΕΙΑ) με σκοπό την ανίχνευση μίας ουσίας, συνήθως ενός αντιγόνου, σε ένα υγρό δείγμα. Η υλοποίηση μίας τέτοιας δοκιμής προϋποθέτει τουλάχιστον ένα αντίσωμα με εξειδίκευση σε ένα συγκεκριμένο αντιγόνο. Η διαδικασία ανίχνευσης και αξιολόγησης της παρουσίας ενός αντιγόνου στο εκάστοτε δείγμα είναι η εξής:
Σε πρώτο στάδιο, το δείγμα με έναν άγνωστο αριθμό αντιγόνων ακινητοποιείται πάνω σε μία στερεή βάση/πλάκα. Έπειτα προστίθεται το κατάλληλο αντίσωμα ανίχνευσης για το είδος των αντιγόνων του δείγματος σχηματίζοντας ένα σύμπλεγμα. Το αντίσωμα ανίχνευσης μπορεί να είναι ομοιοπολικώς συνδεδεμένο με ένα ένζυμο ή μπορεί να ανιχνευθεί με τη σειρά του από ένα δευτερεύον αντίσωμα συνδεδεμένο με ένα ένζυμο με βιο-σύζευξη. Ανάμεσα σε κάθε στάδιο, η πλάκα πλένεται με ένα ήπιο διάλυμα απορρυπαντικού ώστε να απομακρυνθούν τυχούσες πρωτεΐνες ή αντισώματα που δεν δεσμεύτηκαν. Μετά το τελικό στάδιο πλύσης, προστίθεται στην πλάκα ένα ενζυματικό υπόστρωμα για να παράγει ένα ορατό σήμα, το οποίο υποδεικνύει την ποσότητα του αντιγόνου στο δείγμα. Το σήμα αυτό είναι συνήθως η αλλαγή χρώματος του υποστρώματος.


1.png

Εικόνα 1: Αναπαράσταση της μεθόδου

Ως βιοχημική δοκιμή τρυβλίου (plate-basedbiochemicalassay) εννοείται μια τυπική δοκιμή-πείραμα (assay) στη βάση ενός τρυβλίου (plate), συνήθως 96 βοθρίων (πηγαδιών-wells), στο οποίο κάθε βοθρίο περιέχει ένα δείγμα (υγρό διάλυμα/μίγμα), του οποίου τη βιοχημική σύσταση θέλουμε να αναλύσουμε.
Η ονομασία ELISA(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay), συνοψίζει μόνο την αρχική μορφή της τεχνικής. Πρακτικώς δεν αναφέρεται σε μια συγκεκριμένη τεχνική, καθώς υπάρχει μια μεγάλη ποικιλία τεχνικών που χαρακτηρίζονται με αυτό το όνομα, αλλά στην ιδέα που βασίζονται όλες αυτές οι τεχνικές.
2.png


Εικόνα 2: Αρχή λειτουργίας ELISA

Πολυπλεξία (Multiplexability)
Στην κλασσική εκδοχή της, μια μέτρηση με την τεχνική ELISA αναγνωρίζει και ποσοτικοποιεί μόνο έναν αναλύτη ανά δείγμα. Για τις ανάγκες μιας «συστημικής» προσέγγισης, όμως, κάτι τέτοιο δεν είναι αρκετό, καθώς θα έπρεπε για κάθε μετρούμενο σε κάθε διαφορετικό υπό μελέτη ερέθισμα (stimulous), να πραγματοποιείται μια ξεχωριστή μέτρηση. Μια τέτοια διαδικασία θα ήταν εξαιρετικά χρονοβόρα και απαιτητική γι’ αυτό και χρειάστηκε να αναπτυχθούν ειδικές τεχνολογίες για την εκτέλεση πολυπλεκτικών (multiplexed) μετρήσεων.
Πολυπλεκτική (multiplexed) ονομάζεται μια μέτρηση κατά την οποία μετρούνται στο ίδιο δείγμα και ταυτόχρονα πολλοί αναλύτες (τυπικά πάνω από έναν). Στο εργαστήριο η πειραματική δοκιμή ELISA που πραγματοποιήθηκε είναι η λεγόμενη Bead-based Sandwich ELISA.
3.jpg

Εικόνα 3: Αρχή λειτουργίας Multiplexed ELISA


ΧαρακτηριστικάBead-based Sandwich ELISA
Οι αναλύτες, που στην περίπτωση μας είναι κυτταροκίνες (cytokines) και φωσφοπρωτεΐνες (phosphoproteins), ακινητοποιούνται πάνω στην επιφάνεια μικροσφαιρίδιων (beads). Σε αντίθεση με τη συνήθη τεχνική της παθητικής προσρόφησης (adsorption) πάνω σε ακίνητη, επίπεδη επιφάνεια, τα μικροσφαιρίδια (διαμέτρου 5,6μm) έχουν τη δυνατότητα να κινούνται μέσα στο δείγμα καθώς και να επηρεάζονται από τα μαγνητικά πεδία λόγου του σιδήρου που περιέχουν (σε ποσοστό 2%-4%).
Τα μικροσφαιρίδια είναι χρωματισμένα με ειδική φθορίζουσα βαφή, ώστε το κάθε ένα (ή η κάθε ομάδα) να χαρακτηρίζεται από μια ξεχωριστή χρωματική ταυτότητα. Ο διαχωρισμός των μικροσφαιριδίων αποτελεί αναγκαία προϋπόθεση για την πολυπλεξία της μεθόδου, διότι έτσι μπορούμε να αντιστοιχίσουμε τα μικροσφαιρίδια στους διάφορους αναλυτές που μας ενδιαφέρουν.


4.png

Εικόνα 4: set micro-beads
Η προσρόφηση δεν γίνεται απευθείας στην επιφάνεια, αλλά από τα αντισώματα παγίδευσηςπρωτεύον αντίσωμα – Capture/Primary Antibody) με τα οποία έχουν προ-επικαλυφθεί τα μικροσφαιρίδια.
Αυτό το είδος προσρόφησης λέγεται επιλεκτική (specificbinding), διότι τα αντισώματα έχουν την ιδιότητα να αντιδρούν επιλεκτικά, ως ένα βαθμό, με τους αναλύτες, ενώ όταν η προσρόφηση γίνεται απ’ ευθείας στην επιφάνεια τότε λέγεται μη-επιλεκτική, διότι η επιφάνεια δεν έχει την ιδιότητα να ξεχωρίζει τους αναλυτές ή οποιαδήποτε άλλη βιομοριακή ουσία μπορεί να υπάρχει στο δείγμα. Λόγω της χρήσης δύο αντισωμάτων για την ανίχνευση ενός αναλύτη, η τεχνική καλείται SandwichELISA.
5.png
Εικόνα 5: ELISA Μικροσφαιριδίων

Τα αντισώματα ανίχνευσης σημαίνονται με διαφορετικού χρώματος βαφή (πράσινη) από τα μικροσφαιρίδια (συνδυασμός ερυθρής και υπέρυθρης).
Για την μέτρηση, τα μικροσφαιρίδια αφήνονται να επωαστούν πρώτα μαζί με το δείγμα και στη συνέχεια με τα αντισώματα ανίχνευσης και κατόπιν αναγκάζονται να περάσουν μέσα από δύο συστήματα ανίχνευσης φωτεινότητας: ένα για την αναγνώριση της χρωματικής ταυτότητας του μικροσφαιριδίου, η οποία γίνεται μέσω της αναγνώρισης έντασης φωτεινότητας κάθε βαφής και του συνδυασμού τους, και ένα για την αναγνώριση της έντασης φωτεινότητας της βαφής των σημασμένων αντισωμάτων ανίχνευσης, η οποία θεωρείται ανάλογη του πλήθους τους (θεωρείται ότι κάθε αντίσωμα εκπέμπει στην ίδια ένταση).
Τα βασικά πλεονεκτήματα της μεθόδου είναι:
  • Η δυνατότητα καθοδήγησης των μικροσφαιριδίων (είτε μαγνητικά είτε μηχανικά) και άρα αυτοματοποίησης της διαδικασίας
  • Η εξάλειψη των προβλημάτων της αντίδρασης υγρής-στερεάς φάσης
  • Ευκολότερη πολυπλεξία, καθώς αρκεί να προστεθούν στο μίγμα μικροσφαιρίδια διαφορετικών χρωμάτων, ενώ στην επίπεδη επιφάνεια πρέπει να χωριστεί η επιφάνεια σε περιοχές μειώνοντας έτσι την συνολική επιφάνεια αντίδρασης
  • Μεγαλύτερη οικονομία σε χρόνο και κόστος για τον ίδιο όγκο δεδομένων


2. Περιγραφή Πειραματικής Διαδικασίας

Η διεξαγωγή των πειραματικών μετρήσεων πραγματοποιήθηκε σε καρκινικά ηπατοκύτταρα της κυτταρικής σειράς “Ηuh 7”. Η διαφορά της συγκεκριμένης κυτταρικής σειράς από την άλλη πειραματικώς χρησιμοποιηθείσα έγκειται στο είδος του καρκίνου (όργανο προέλευσης των κυττάρων).
Η διαδικασία περιλαμβάνει τα εξής βήματα (όπως πραγματοποιήθηκαν και σύμφωνα ΠΑΝΤΑ με το πρωτόκολλο του εργαστηρίου):
  • Ξεπάγωμα κυττάρων και δημιουργία culture
Τα κύτταρα βρίσκονταν μέσα σε υγρό άζωτο σε θερμοκρασία -196ο C.

6.png

Εικόνα 6: Υγρό άζωτο

Σημείωση:Οφείλεται να σημειωθεί σε αυτό το σημείο πως η εργαστηριακή διαδικασία του «cellculture» πραγματοποιήθηκε αρκετές φορές μιας και η απόπειρα για δημιουργία μιας ανθεκτικής καλλιέργειας τις πρώτες φορές ήταν ανεπιτυχής. Πιο συγκεκριμένα, τα κύτταρα έπαθαν μόλυνση contamination»), φαινόμενο το οποίο μπορεί να αποδοθεί σε αρκετούς λόγους ενδογενείς της διαδικασίας (λάθη που ενδεχομένως έγιναν κατά τη διεξαγωγή του πειράματος), αλλά και εξωγενείς (εργαστηριακές συνθήκες, πιθανή παρουσία κάποιου μικροβίου, κλπ).
  • Change culture media
Σε αυτό το δεύτερο βήμα «τρέφουμε» τα κύτταρα με τις κατάλληλες θρεπτικές ουσίες, ώστε να αναπτυχθούν. Το media αποτελεί μία υγρή ουσία, η οποία περιέχει κύρια θρεπτικά συστατικά για την ανάπτυξη των κυττάρων. Η κύρια σύσταση του είναι νερό, ζάχαρη (γλυκόζη) καιFBS (Fetal ΒovineSerum),που το προσθέτουμε στο media πριν το χρησιμοποιήσουμε διότι έχει ένα πολύ χαμηλό επίπεδο αντισωμάτων και περιέχει περισσότερους αυξητικούς παράγοντες. Το βήμα αυτό επαναλαμβάνεται περίπου ανά 3-4 μέρες μέχρις ότου έχουμε τον κατάλληλο αριθμό κυττάρων για να ακολουθήσει το επόμενο βήμα.
  • Split

Το τρίτο αυτό βήμα πραγματοποιείται αφού παρατηρηθεί η ραγδαία ανάπτυξη των κυττάρων. Η εξεταζόμενη περίπτωση πραγματεύεται καλλιέργεια καρκινικών κυττάρων, άρα το διάστημα αυτό είναι σχετικά μικρό σε σύγκριση με το αντίστοιχο των υγιών κυττάρων (υψηλός ρυθμός ανάπτυξης- “growth rate” 3-4 ημέρες). Πρακτικά σε αυτό το βήμα «δίνουμε χώρο» στα κύτταρα να αναπτυχθούν κι άλλο, δηλαδή τα μεταφέρουμε σε ένα ή περισσότερα petri dishes δημιουργώντας την κατάλληλη συγκέντρωση, ακολουθώντας πάντα αυστηρά το πρωτόκολλο του εργαστηρίου.
  • ΕLISA
Η διαδικασία της ELISA, όπου ήταν και το τελικό πείραμα κράτησε τρεις μέρες:




  • Ημέρα 1η Platting


7.png

Εικόνα 7: Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο παρατήρησης κυττάρων

  • Την πρώτη ημέρα του τελικού πειράματος τοποθετούμε τα κύτταρα στα πηγάδια των plates(wells) και τα αφήνουμε overnight έτσι ώστε να «κάτσουν» στον πάτο για να ακολουθήσει το stimulus (ερέθισμα). Πριν τα τοποθετήσουμε στα well μετράμε με τη διαδικασία του counting (χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου)τα κύτταρα έτσι ώστε να έχουμε τον κατάλληλο αριθμό κυττάρων σε κάθε well. Στα well μας έχουμε στην πρώτη στήλη στα πρώτα 5 (Α-Ε) κύτταρα και στα επόμενα 3(F-H) μόνο media (DME).


  • Ημέρα 2η Stimulation


8.png

Εικόνα 8: Τυποποιημένο πλακίδιο 96 βοθρίων

Την δεύτερη ημέρα της ΕLISA βάζουμε το TNFa (ερέθισμα) στα κύτταρα.
  • ΗΜΕΡΑ 3η ELISA
9.png

Εικόνα 9: Πειραματική διαδικασία-έναρξη
Αρχικά, ο κάθε πειραματιστής παίρνει από τα well 90 ul από τα 100 του υγρού από πάνω (supernatant-το οποίο περιέχει το TNFa που βάλαμε την προηγούμενη μέρα και τις πρωτεΐνες που έχουν βγάλει τα κύτταρα αυτήν την μια ημέρα), κάνοντας προσεκτικά ups and downs(γιατί οι πρωτεΐνες βρίσκονται κοντά στα κύτταρα προσοχή: δεν θέλουμε να πάρουμε κύτταρα γιατί στο luminex μετά θα εμφανιστούν σαν θόρυβος)

10.png

Εικόνα 10: Περιβάλλον συνθηκών επώασης (incubator)

Kαι τα βάζει σ ένα plate όλοι μαζί ο καθένας στη στήλη του και το τοποθετούμε στο ψυγείο. Στη συνέχεια σκοτώνουμε τα εναπομείναντα κύτταρα με αιθανόλη.
Παίρνουμε δύο δοχεία (boats) και βάζουμε

(α) στο πρώτο τα beads τα οποία διαλύουμε στο PBSw/BSA 1%
11.png
Εικόνα 11: Πειραματική διαδικασία-ανάδευση

Πριν ρίξουμε τα beads στο boat τα ανακατεύουμε καλά στο shaker για να αποφύγουμε το ενδεχόμενο να έχουν κολλήσει μεταξύ τους καθώς είναι μαγνητικά.
Τα beads είναι φωτοφοβικά κι έτσι όλη η διαδικασία από εδώ κι πέρα γίνεται με κλειστά τα φώτα. Τέλος, επειδή είναι μικρή ποσότητα (2 ul όπως έχει προκύψει από πειράματα) προσέχουμε να τα ρίξουμε σε όλο το boat.
(β) στο δεύτερο boat ρίχνουμε σκέτο PBSw/BSA 1%( αρκετή ποσότητα) το οποίο το χρησιμοποιούμε για να κάνουμε τα washes και ονομάζουμε το boat ¨assaybuffer ¨.
12.png
Εικόνα 12: Πειραματική διαδικασία-boats


Με pipette παίρνουμε 50ul από το διάλυμα των beads και το ρίχνουμε στα wells.


13.png
Εικόνα 13: Πειραματική διαδικασία-μαγνητική πλάκα


Τοποθετούμε το plate σε μαγνητική πλάκα για ενάμιση λεπτό για να κολλήσουν τα beads, Με αυτό τον τρόπο, θα έχουμε μόνο καθαρά beads, και αφού περάσει το ενάμιση λεπτό αδειάζουμε το περιεχόμενό του απότομα στον κουβά.

14.png
Εικόνα 14: Πειραματική διαδικασία-shaker

Στη συνέχεια κάνουμε ένα wash με το assay buffer και παίρνουμε τα beads και τα ρίχνουμε στο supernatant, κολλώντας από πάνω ένα αυτοκόλλητο (μιας και η ποσότητα είναι μικρή και υπάρχει κίνδυνος να εξατμιστεί) και τα τοποθετούμε αυστηρά για μιάμιση ώρα στο shaker έτσι ώστε να ανακατευτούν.
Detectionphase:Βγάζουμε το αυτοκόλλητο και το τοποθετούμε στην μαγνητική πλάκα και περιμένουμε ενάμιση λεπτό για να βγάλουμε το υγρό που αναδευόταν. Στη συνέχεια αδειάζουμε το περιεχόμενο στον κουβά. Κάνουμε 2 washes με assay buffer περιμένοντας ενάμιση λεπτό κάθε φορά. Bάζουμε το secondary antibody , το αυτοκόλλητο και το τοποθετούμε ξανά στο shaker περιμένοντας μία ώρα αυτή τη φορά, πάντα ενώ βρισκόμαστε σε συνθήκες χαμηλού φωτισμού.
Βγάζουμε από το shaker το plate και το βάζουμε στη μαγνητική πλάκα χωρίς να ρίξουμε το υγρό που έχει μέσα γιατί είναι πολύ λίγο και δεν θα πέσει, βάζουμε 100 ul και κάνουμε wash όπως πριν( 2 washes), βάζουμε 50 ul PE/well με την pipette και το βάζουμε στο shaker για 15 λεπτά αυτή τη φορά.
Τέλος, το βγάζουμε από το shaker, το βάζουμε στη μαγνητική πλάκα και ρίχνουμε στον κουβά το υγρό με το ΡΕ μετά από ενάμιση λεπτό και κάνουμε ένα wash.
Βάζουμε το υγρό resuspend (το υγρό που διαβάζει το luminex) και το βάζουμε για τελευταία φορά για ένα λεπτό στο shaker. Τέλος το βγάζουμε και το τοποθετούμε στο luminex για να πάρουμε τα αποτελέσματα.

3. Επεξήγηση δεδομένων-cytokine
Παρακάτω περιγράφεται και αναλύεται συνοπτικά το ερέθισμα που δόθηκε στα κύτταρα κατά τη διεξαγωγή της δοκιμής ΕLISA, καθώς και τα σήματα/αποκρίσεις αυτών στο εν λόγω ερέθισμα. Για την καλύτερη κατανόηση τους κρίθηκε σκόπιμο να δοθούν αρχικά οι ορισμοί κάποιων βασικών όρων που χρησιμοποιούνται στη συνέχεια.
Μονοπύρηνα ή μονοκύτταρα είναι τα κύτταρα του αίματος με διακριτό πυρήνα που συμμετέχουν στην άμυνα του οργανισμού και μεταναστεύουν στους ιστούς που προσβάλλονται από παθογόνους μικροοργανισμούς. Συγκαταλέγονται στα λευκά αιμοσφαίρια του αίματος, είναι πρόδρομοι των μακροφάγων και ανήκουν στο σύστημα των φαγοκυττάρων.
Μακροφάγαονομάζονται τα μεγάλα μονοπύρηνα φαγοκύτταρα σημαντικά στην φυσική ανοσία, στις πρώιμες φάσεις του ξενιστή, ως κύτταρα παρουσίασης αντιγόνου και ως δραστικά κύτταρα στη χημική και κυτταρική ανοσία. Παράγονται στο μυελό των ιστών και στη συνέχεια αποδεσμεύονται στην κυκλοφορία και μεταναστεύουν στους ιστούς. Αποτελούν τον δεύτερο μεγαλύτερο κυτταρικό πληθυσμό του ανοσιακού συστήματος και αποτελούν τις ώριμες μορφές των μονοκυττάρων, παίρνοντας διάφορες μορφές κατά τη διαφοροποίηση τους και την ενεργοποίηση τους .
Κυτταροκίνες( κυτταρο και -κίνη = κίνηση) λέγονται τα μικρά κύτταρα σηματοδοτικά πρωτεινικών μορίων που εκκρίνονται από πολυάριθμα κύτταρα και αποτελούν μια κατηγορία σηματοδοτικών μορίων που χρησιμοποιούνται εκτενώς στην ενδοκυτταρική επικοινωνία. Οι κυτταροκίνες μπορούν να ταξινομηθούν ως πρωτεΐνες, πεπτίδια, ή γλυκοπρωτεΐνες. Ο όρος «κυτταροκίνη» περικλείει μια μεγάλη και ποικιλόμορφη οικογένεια ρυθμιστών που παράγονται σε όλο το σώμα από κύτταρα διαφορετικής εμβρυολογικής προέλευσης.
Χημειοκίνεςείναι μία οικογένεια μικρών κυτταροκινών ή πρωτεινών που εκκρίνονται από κύτταρα. Η ονομασία τους προέρχεται από την ικανότητά τους να επάγουν απευθείας χημειοταξία (κίνηση κυττάρων ως αποτέλεσμα κάποιου χημικού ερεθίσματος) στα γυρώ ανταποκρινόμενα κύτταρα. Είναι, δηλαδή, χημειοτακτικές κυτταροκίνες. Οι πρωτεΐνες ταξινομούνται ως χημειοκίνες σύμφωνα με κοινά δομικά χαρακτηριστικά, όπως το μικρό μέγεθος και η παρουσία των τεσσάρων υπολειμμάτων κυστεΐνης σε συντηρημένες περιοχές που είναι το κλειδί για το σχηματισμό της 3-διάστατης μορφής.
Κατά την δοκιμή ELISA που πραγματοποιήθηκε το ερέθισμα (stimulus) που δόθηκε στα κύτταρα ήταν το ΤNFa(παράγοντας νέκρωσης των όγκων α ). Πρόκειται για μία ισχυρή ανοτροποποιητική κυτταροκίνη με αποδεδειγμένη ογκοκτόνο δράση, που εμπλέκεται στη συστημική φλεγμονή και είναι μέρος μίας ομάδας κυτταροκινών που διεγείρουν την αντίδραση οξείας φάσεως. Εκκρίνεται κυρίως από μακροφάγα παρόλο που μπορεί να παραχθεί και από άλλους τύπους κυττάρων, όπως λεμφοκύτταρα και κύτταρα ΝΚ (naturalkillers). Ο βασικός ρόλος του TNF είναι η ρύθμιση των κυττάρων του ανοσοποιητικόυ συστήματος. Πρόκειται στην ουσία για ένα ενδογενές πυρετογόνο, ικανό να προκαλέσει πυρετό για να προκληθεί αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος, σήψη, καχεξία, φλεγμονή, και να ανασταλλεί η ογκογένεση και αντιγραφή του ιού. Η δυσρύθμιση της παραγωγής TNFσχετίζεται με μία ποικιλία ασθενειών του ανθρώπου, συμπεριλαμβανομένης της νόσου του Alzheimer, του καρκίνου, της κατάθλιψης και της φλεγμονώδους νόσου του εντέρου.
Η μελέτη της ανταπόκριση των κυττάρων στο παραπάνω ερέθισμα επικεντρώθηκε στη μέτρηση συγκεκριμένων κυτταροκινών, των οποίων οι λειτουργίες και επιδράσεις περιγράφονται στη συνέχεια :
- IP10 (cxcl10)
Είναι μία μικρή κυτταροκίνη, η οποία ανήκει στην οικογένεια των C-X-C χημειοκινών. Βρίσκεται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 4, σε ένα σύμπλεγμα μεταξύ πολλών άλλων CXC χημειοκινών. Εντοπίζεται σε ιστούς και σωματικά υγρά. Η χημειοκίνη αυτή εκκρίνεται από διάφορους τύπους κυττάρων ως απόκριση στο IFN-γ και της έχουν αποδοθεί ποικίλοι ρόλοι , όπως χημειοέλξη για μονοκύτταρα / μακροφάγα, Τ κύτταρα, ΝΚ κύτταρα, και δενδριτικά κύτταρα, ενώ πάιζει σημαντικό ρόλο σε διάφορες ενδοκρινολογικές, αυτοάνοσες νόσους όπως η θυροειδίτιδα Hachimoto. Ακόμη, συνδέεται με γλυκοσαμινογλυκάνες (GAGs), μια αλληλεπίδραση που θεωρείται ιδιαίτερα σημαντική για τον εγκλωβισμό της σε ενδοθηλιακά και άλλα κύτταρα. Η επίδραση της εκδηλώνεται με τη δέσμευσης του στην κυτταρική επιφάνεια μέσω του υποδοχέα χημειοκινών CXCR3, o οποίος βρίσκεται κυρίως σε ενεργοποιημένα Τ-κύτταρα και ΝΚ (naturalkiller) κύτταρα και πάιζει σηματνικό ρόλο σε τύπου Th1 φλεγμονώδεις ασθένειες.
- ΕOT (cclII_)
Πρόκειται για την ηωταξίνη -1, η οποία αποτελεί ένα χημειοτακτικό παράγοντα που προσελκύει ειδικά τα ηωσινόφιλα κύτταρα σε συγκεκριμένους ιστούς (π.χ. στο βρογχικό δέντρο, στο άσθμα ή στο δέρμα στη δερματίτιδα εξ επαφής). Ο παράγοντας νέκρωσης των όγκων α (ΤNFa) διεγείρει την απελευθέρωση της. Σημειώνεται εδώ ότι τα ηωσινόφιλα κύτταρα είναι μια κατηγορία πολυμορφοπύρηνων λευκών αιμοσφαιρίων, συστατικά του ανοσοποιητικού συστήματος, τα οποία είναι υπεύθυνα για την καταπολέμηση πολυκύτταρων παράσιτων και ορισμένων λοιμώξεων και ελέγχουν μηχανισμούς που σχετίζονται με τις αλλεργίες και το άσθμα.
- MP1a(ccl3)
Η CCL3, γνωστή και ως φλεγμονώδης πρωτείνη μακροφάγων (ΜΙΡ)- 1α, είναι μία κυτταροοκίνη που ανήκει στην οικογένεια των CC χημειοκινών, η οποία, κατά την οξεία φλεγμονώδη κατάσταση, εμπλέκεται στη στρατολόγηση και ενεργοποίηση των πολυμορφοπύρηνων λευκοκυττάρων. Γενικά, είναι γνωστή για τις χημειοτακτικές και προφλεγμωνώδεις επιδράσεις της, αλλά μπορεί να προάγει και την ομοιοσύσταση. Εκκρίνεται από πολλά κύτταρα, ιδιαίτερα από μακροφάγα, δενδρικά και λεμφοκύτταρα. Αποτελεί βασικό στοιχείο που παράγεται από μακροφάγα τα οποία έχουν διεγερθεί με βακτηριακές ενδοτοξίνες και έχει μεγάλη σημασία για ανοσοαποκρίσεις έναντι λοιμώξεων και φλεγμονών. Ενεργοποιεί ανθρώπινα κοκκιοκύτταρα τα οποία μπορούν να προκαλέσουν οξεία ουδετεροφιλική φλεγμονή. Μπορεί, επίσης, να προκαλέσει την σύνθεση και την απελευθέρωση άλλων προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών, όπως η ιντερλευκίνη 1 (IL-1), IL-6 και ΤΝΡ-α από ινοβλάστες και μακροφάγα.
- GROa
Πρόκειται για μία χημειοκίνη, γνωστή και ως CXCL1, η οποία έχει μιτογονικές ιδιότητες και χημειοέλκει ουδετερόφιλα τα οποία αποτελούν τον μεγαλύτερο πληθυσμό των λευκών αιμοσφαιρίων. Μπορεί να παίζει ρόλο σε φλεγμονές και επιδρά στα ενδοθηλιακά κύτταρα με αυτοκρινή τρόπο. Εκκρίνεται από μακροφάγα, επιθηλιακά κύτταρα, ουδετερόφιλα και μελανώματα. O αντίστοιχος υποδοχέας για την GROa είναι ο CXCL2 και εμπλέκεται σε διαδικασίες σχηματισμού του νωτιαίου μυελού, καθώς και σε φλεγμονές,στην αγγειογένεση, ογκογένεση και στην επούλωση τραυμάτων. Ο παράγοντας αυτός είναι κυρίως γνωστός για τη χημειοτακτική του δραστηριότητα.
Για την υλοποίηση της δοκιμής ELISA χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικές κυτταροσειρές καρκινικών ηπακυττάρων τα Huh-7 και FOCUS.
ΗuH-7 είναι καλά διαφοροποιημένα ηπατοκύτταρα προερχόμενα από μία κυτταρική γραμμή καρκινώματος που είχε αρχικά ληφθεί από έναν όγκο ήπατος ενός 57χρονου Ιάπωνα το 1982. Η γραμμή ιδρύθηκε από τους Nakabayshi, Η. και Sato, J και στην ουσία είναι μία αθάνατη κυτταρική γραμμή επιθηλιακών κυττάρων που παρουσιάζουν ογκογονική ομοιότητα.
Τα FOCUS είναι μία κυτταροσειρά από ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό και προήλθε από έναν ασθενή με πρωτογενές ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. Αυτή η κυτταρική γραμμή έχει σε συνεχή καλλιέργεια κατά τη διάρκεια μιας 18-μηνης περιόδου.


15a.png


15d.png

Εικόνα 15(a)(b): Μέσοι Όροι αποκρίσεων για κάθε πειραματιστή (TNFa-DME)



16.png
Εικόνα 16: Μέσοi Όροι αποκρίσεων όλων των πειραματιστών (TNFa-DME)

17ar.png
(a) EOT(TNFa-DME)

17dexia.png
(b)GROA(TNFa-DME)


untitled 2.JPG
(c)IP10(TNFa-DME)

untitled 3.JPG
(d)MP1a(ccl3)

Εικόνα 17(a)-(d): Μέσοi Όροi αποκρίσεων κάθε πειραματιστή για κάθε μετρούμενο cytikine (TNFa-DME)

4. Δοκιμασία t του Student: Σύγκριση δύο μέσων τιμών
Μεταξύ των συνηθέστερα χρησιμοποιούμενων στατιστικών δοκιμασιών σημαντικότητας (significance tests), που εφαρμόζονται σε μικρές ομάδες δεδομένων (πληθυσμιακά δείγματα), είναι η σειρά των δοκιμασιών Student. Μια από αυτές τις δοκιμασίες πραγματοποιεί σύγκριση δύο μέσων τιμών και χρησιμοποιείται σε πλήθος περιπτώσεων. Τυπικές περιπτώσεις εφαρμογής είναι:
Περίπτωση 1: Σύγκριση αναλυτικών αποτελεσμάτων που ελήφθησαν με την ίδια μέθοδο στα δείγματα Α και Β, για να διαπιστωθεί αν τα δείγματα περιέχουν τη μετρούμενη ουσία σε ίδιο ή διαφορετικό ποσοστό.
Περίπτωση 2: Σύγκριση αναλυτικών αποτελεσμάτων με δύο διαφορετικές μεθόδους Α και Β στο ίδιο δείγμα, για να διαπιστωθεί αν οι δύο μέθοδοι παρέχουν ίδια ή διαφορετικά αποτελέσματα.
Στη συγκεκριμένη πειραματική διαδικασία εξετάστηκε η περίπτωση 1.

Αρχικά, για τη διεξαγωγή του t-test διατυπώνεται η μηδενική υπόθεση (Ho ).Η υπόθεση αυτή είναι ουσιαστικά η πρόταση η οποία υποδεικνύει εάν οι μέσες τιμές των δύο υπό εξέταση δειγμάτων είναι ίδιες, δηλ. για την Περίπτωση 1: η περιεκτικότητα των δύο δειγμάτων, σε προσδιοριζόμενη ουσία είναι η ίδια.
Η εναλλακτική υπόθεση(alternative hypothesis) (Ηa) δηλώνει το ακριβώς αντίθετο.


Διευκρινίζεται ότι για το πείραμα μας, τα δύο δείγματα είναι οι δύο διαφορετικές κυτταροσειρές: ΗuH-7 (δείγμα Α) και FOCUS (δείγμα Β) και η προσδιοριζόμενη ουσία είναι η κάθε κυτταροκίνη που μετρήθηκε μέσω της δοκιμής ELISA.

Στη συνέχεια καθορίζεται η στάθμη εμπιστοσύνης για την οποία θα διεξαχθεί το στατιστικό τεστ. Γενικά, όλες οι δοκιμασίες σημαντικότητας παρέχουν αποτελέσματα σε προκαθορισμένη στάθμη εμπιστοσύνης % (confidence level, CL%). Οι πλέον χρησιμοποιούμενες στάθμες εμπιστοσύνης είναι 90%, 95% και 99%, με πλέον συνηθισμένη (τουλάχιστον στο πεδίο της χημικής ανάλυσης) το 95%.
CL95%σημαίνει ότι: Σε περίπτωσης απόρριψης της Ho, είμαστε σίγουροι ότι κάναμε το σωστό στο 95% ή περισσότερο των περιπτώσεων. Με άλλα λόγια, διακινδυνεύουμε μια πιθανότητα όχι μεγαλύτερη από (100-95)/100 = 0,05 να κάνουμε σφάλμα 1ου είδους.
Μπορούμε να αυξήσουμε ή να μειώσουμε τη στάθμη εμπιστοσύνης μιας δοκιμασίας σημαντικότητας, αλλά θα πρέπει να λάβουμε υπόψη τους ακόλουθους κινδύνους:
(α) Ελαττώνοντας τη CL π.χ. στο 90% (κάνοντας πιο εύκολη την απόρριψη της H0) προφανώς αυξάνουμε την πιθανότητα σφάλματος 1ου είδους.
(β) Αυξάνοντας τη CL π.χ. στο 99% (κάνοντας δυσκολότερη την απόρριψη της H0) προφανώς αυξάνουμε την πιθανότητα σφάλματος 2ου είδους.
Μια CL 95% γενικά θεωρείται ως ένας καλός συγκερασμός μεταξύ αυτών των δύο διαφορετικών κινδύνων.
Με χρήση κατάλληλου applet (designedbyC.E.Efstathiou, DepartmentofChemistry, UniversityofAthens, Greece) πραγματοποιήθηκε το t-test και για τις τέσσερις περιπτώσεις αποκρίσεων. Εισάγουμε τα αριθμητικά δεδομένα του πειράματος για κάθε κυτταροσειρά και το appletσυγκρίνει τις μέσες τιμές των δύο δειγμάτων σε στάθμες εμπιστοσύνης (CL) 90%, 95% and 99%. Το αποτέλεσμα της κάθε σύγκρισης ερμηνεύεται σε όρους θετικής (the means ARE different: οι μέσες τιμές διαφέρουν) ή αρνητικής (the means ARE NOT different: οι μέσες τιμές δεν διαφέρουν) ανίχνευσης σημαντικής διαφοράς μεταξύ των μέσων τιμών σε στάθμες εμπιστοσύνης (CL) 90%, 95% and 99%.
Τα αποτελέσματα απεικονίζονται παρακάτω τόσο για τα διεγερμένα (TNFa) όσο και για τα μη διεγερμένα κύτταρα (DME):
18.jpg
Εικόνα 18. ΕΟΤ (DME)

19.jpg
Eικόνα 19. ΕΟΤ (TNFa)

20.jpg
Eικόνα 20. GROa (DME)

21.jpg
Εικόνα 21. GROa (TNFa)


22.jpg
Εικόνα 22. ΙP10 (DME)


23.jpg
Eικόνα 23. IP10 (TNFa)


24.jpg
Εικόνα 24. MIP1A (DME)
untitled.JPG

Εικόνα 25: MIP1A (TNFa)


Από τα παραπάνω t-testσυμπεραίνουμε ότι ουσιαστικά, οι δύο κυτταροσειρές συμπεριφέρονται όμοια μόνο ως προς την κυτοκίνη EOT, τόσο σε περίπτωση διέγερσης όσο και σε περίπτωση διέγερσης με TNFa. Ως προς τις υπόλοιπες αποκρίσεις παρουσιάζουν σημαντική διαφορά όπως προέκυψε από τα παραπάνω.
Τέλος, παρουσιάζονται παρακάτω τα πειραματικά διαγράμματα σύγκρισης:

26.png
Εικόνα 26: Πειραματική Σύγκριση Huh7-Focus
25.png

Εικόνα 27: Πειραματική Σύγκριση Huh7-Focus





5. Τεχνική anova


Παράμετροι πειράματος

X1:Μετρούμενο σήμα (ΕΟΤ, GROA,IP10,MIP1A)
X2: Ερέθισμα (TNFa , DME)
X3:Πειραματιστές (Βασίλης, Ιφιγένεια, Τέρυ, Μαρίνα)




untitled4.JPG


Εικόνα 28: Μετρούμενο Σήμα


untitled5.JPG


Εικόνα 29: Ερέθισμα





untitled6.JPG
Εικόνα 30: Πειραματιστές


Στα διαγράμματα αυτά έχουμε πάρει τους μέσους όρους όλων των μετρήσεων που αφορούν ένα συγκεκριμένο μέγεθος, προσπαθώντας να βγάλουμε ένα γενικό συμπέρασμα για τη συμπεριφορά της κάθε παραμέτρου.

Όσον αφορά την πρώτη παράμετρο, δηλαδή το μετρούμενο σήμα, παρατηρούμε ότι οι τέσσερις αποκρίσεις διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους, χωρίς να επικαλύπτονται σε καμία περιοχή, δηλαδή το συμπέρασμα που εξάγεται από εδώ είναι ότι έχει σημασία το ποιο σήμα μετράμε κάθε φορά.

Όσον αφορά τη δεύτερη παράμετρο, που έχει να κάνει με το αν έχουμε βάλει στο δείγμα μας κάποιο ερέθισμα ή όχι, παρατηρούμε πάλι ότι οι διαφορές είναι σημαντικές. Δηλαδή σε καμία περίπτωση δεν θα μπορούσαμε να πούμε ότι ένα δείγμα με ερέθισμα και ένα χωρίς, θα μπορούσαν να δώσουν παρεμφερή αποτελέσματα.

Τέλος, όσον αφορά την τρίτη παράμετρο παρατηρείται μια ιδιαίτερη μορφή. Το αξιοσημείωτο εδώ είναι ότι ενώ δύο από τους πειραματιστές έχουν πολύ μεγάλη αλληλεπικάλυψη στο εύρος τους, οι άλλοι δύο , έχουν μια σχετική επικάλυψη με τους πρώτους δύο, αλλά κανένα κοινό σημείο μεταξύ τους. Το συμπέρασμα που μπορούμε να βγάλουμε από εδώ είναι ότι ο πειραματιστής παίζει σημαντικό ρόλο στα αποτελέσματα ενός πειράματος, κυρίως γιατί ακόμα και αν ένα πείραμα εκτελείται ταυτόχρονα από διαφορετικά άτομα, κάτω από τις ίδιες ακριβώς συνθήκες, δεν είναι δυνατόν να πραγματοποιηθούν όλα τα πειράματα με την ίδια ακρίβεια και με τον ίδιο ακριβώς τρόπο.



Τέλος βλέπουμε ένα συγκεντρωτικό πίνακα με όλες τις παραμέτρους του πειράματος και τη βαρύτητα κάθε μια από αυτές στο πείραμα που πραγματοποιήθηκε.


untitled7.JPG


Εικόνα 31: Analysis of variance










Βιβλιογραφία

  • “Ανάπτυξη τεχνικής μέτρησης βιολογικών σημάτων υψηλής ευαισθησίας”, διπλωματική εργασία Μεσσήνη Δημήτρη,Αθήνα, Οκτώβριος 2011
  • “Μοντελοποίηση και Βεκτιστοποίηση Θορύβου σε Πολυπλεκτικά Πειράματα Elisa”, διπλωματική εργασία Σακελλαρόπουλου Θεόδωρου,Αθήνα Οκτώβριος 2012
  • Σημειώσεις του μαθήματος (https://biotech-ntua.wikispaces.com/home),Επιμέλεια: Γεωργία Τσιμπούκη, PhD Student, NTUA