2012-2013

Control theory in Systems Biology

Μοντελοποίηση ενεργοποίησης των MAPkinases σε καρκινικά ηπατοκύτταρα.


Γεωργιάδης Χρήστος

(email: chris_geo_90@hotmail.com)

Σταυρόπουλος-Βασιλάκης Άκης

(email: braff1990@yahoo.gr)

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε τον Γιάννη Μελά από το εργαστήριο Συστημικής Βιολογίας και Εμβιομηχανικής της σχολής Μηχανολόγων Μηχανικών του ΕΜΠ, για την βοήθειά του και την καθοδήγηση για την εκπόνηση αυτής της εργασίας.



Cell Signalling


Η διαδικασία της μετάδοσης σημάτων στα (ή από τα ) κύτταρα (cell signalling) καθορίζει πολλές από τις δραστηρίοτητες τους και ορίζει τον τρόπο με τον οποίο τα κύτταρα αντιλαμβάνονται και αναδύουν στο περιβάλλον τους.
Τα περισσότερα κυτταρικά σήματα μεταφέρονται από βιομόρια.
Για να λάβει το κύτταρο ένα εξωκυτταρικό σήμα, πρέπει να ενεργοποιηθούν οι υποδοχείς που υπάρχουν στην μεμβράνη τους από τα διάφορα βιομóρια που μεταφέρουν την εκάστοτε πληροφορία, οι οποίοι με την σειρά τους την μεταφέρουν μέσα στο κύτταρο. Τα βιομόρια που ενεργοποιούν αυτούς τους υποδοχείς μπορεί να ναι ορμόνες, νευροδιαβιβαστής, κυτοκίνες ή growth factors. Όλα αυτά τα ομαδοποιούμε και τα ονομάζουμε receptor ligands (συνδέτες υποδοχέων). Για να μεταφέρουν την πληροφορία μέσα στο κύτταρο, οι ενεργοποιημένοι υποδοχείς πρέπει να αλληλεπιδράσουν με άλλες ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες. Ολόκληρη αυτή η σειρά αντιδράσεων, που συνδέει τους υποδοχείς με τον πυρήνα του κυττάρου, αποκαλείται σηματοδοτικό μονοπάτι - Signalling Pathway.

Mitogen-activated protein kinases: Πρωτεϊνικές Κινάσες Ενεργοποιημένες από Μιτογόνα


Οι MAPKs είναι πρωτεϊνικές κινάσες, οι οποίες εμπλέκονται στην οργάνωση των αποκρίσεων του κυττάρου σε ένα ευρύ φάσμα εξωτερικών ερεθισμάτων. Μεταξύ άλλων καθορίζουν τον πολλαπλασιασμό,την διαφοροποίηση, την μίτωση, την επιβίωση των κυττάρων, την απόπτωση (προγραμματισμένο θάνατο του κυττάρου) και την έκφραση των γονιδίων.
Ανήκουν στην κατηγορία των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/θεονίνης, οι οποίες είναι ένζυμα κινάσες που φοσφοριλιάζουν το σύμπλεγμα ΟΗ των δύο αυτών αμινοξέων. Η φωσφοριλίαση αυτή γίνεται με συγκεκριμένες ουσίες οι οποίες όμως εμφανίζονται σε πολυάριθμα συμπλέγματα, καθιστώντας αυτές τις κινάσες ευαίσθητες σε ολόκληρες οικογένειες συμπλεγμάτων ουσιών.

Οι MAPKs αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια πρωτεϊνών που βρίσκονται σε θηλαστικά, φυτά και μύκητες (Erk1/2) Φαίνεται να έχουν πολύ συγκεκριμένη και όχι γενική λειτουργιά και εμπλέκονται στις διαδικασίες μετάδοσης σήματος στο κύτταρο και ευθύνονται για τις απαντήσεις του κυττάρου σε εξωτερικά ερεθίσματα.
Η οικογένεια αυτή παρουσιάζει κάποια κοινά χαρακτηριστικά όπως ότι ενεργοποιούνται με διπλή φωσφοριλίαση και η ενεργοποίηση τους οργανώνεται σε τριών επίπεδων pathways.
Υπάρχουν και κάποιες κινάσες αυτής της οικογενείας που ενεργοποιούνται με απλή φωσφοριλίαση (σε τρία επίπεδα πάλι) οι οποίες καλούνται άτυπες (atypical).
Η φωσφοριλίαση γίνεται από εξειδικευμένα ένζυμα της οικογένειας STE και χρειάζεται και στα δυο τμήματα, και στο τμήμα της θεονίνης και της τυροσίνης (TxY motif)
Η ενεργοποίηση των ΜAPK γίνεται από την οικογένεια των MAP2Κ κινασών (γνωστών και ως STE), οι οποίες με την σειρά τους ενεργοποιούνται από τις ΜAP3K. Αυτές ενεργοποιούνται από ερεθίσματα της κυτταρικής μεμβράνης, κι με αυτόν τον τρόπο, μέσα από ένα πολυεπίπεδο μονοπάτι, το ερέθισμα φτάνει από τις MAPK στον πυρήνα του κυττάρου.
Η ενεργοποίηση των MAPK γίνεται με κάποια ένζυμα (φωσφοτάσες) τα οποία υδρολύουν τα φωσφορικά και των δυο μερών.

MAPK pathway

Το pathway των MAPK ξεκινάει από έναν υποδοχέα και καταλήγει στο DNA του πυρήνα, όπου οδηγεί στην εκπομπή κάποιας πρωτεΐνης ή κάποιας αλλαγής στο κύτταρο.
Ένα αρκετά κλασικό pathway είναι αυτό του EGF. Αυτό ξεκινάει με το EGF να ενεργοποιεί τον EGFR υποδοχέα (φωσφοριλιόνοντας τα δυο μέρη θυροσίνης), στα οποία στη συνέχεια κολλάει η πρωτεΐνη GRB2. Σε αυτή κολλάει και εν συνεχεία ενεργοποιείται η πρωτεΐνη SOS, η οποία με την σειρά της επενεργεί στην Ras διώχνοντας το τμήμα του GDP και δίνοντας έτσι την δυνατότητα να κολλήσει στην Ras ένα τμήμα GTP και να την ενεργοποιήσει.
Από εκεί ξεκινάει και το τριών επιπέδων cascade των κινασών με την ενεργοποίηση από την Ras της Raf (MAP3K), εν συνεχεία του MEK (MAP2K) και τέλος του ERK (MAPK).

Οι MAPK ως θεραπευτικός στόχος


Το pathway της ERK σχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό του κυττάρου. Γι αυτό έχει μεγάλο ενδιαφέρον η μελέτη και η κατανόηση του μηχανισμοί του, ώστε σε περιπτώσεις ανεπιθύμητου πολλαπλασιασμού του κυττάρου (καρκίνος) να μπορούμε να επεμβαίνουμε και να σταματάμε την μετάδοση αυτής της λανθασμένης εντολής. Έτσι, inhibitors (αναστολείς) της ERK είναι πολύ επιθυμητοί. Προς το παρόν δεν έχουν εφαρμοστεί κλινικά τέτοια inhibitors, αλλά αντίστοιχοι της Raf (MAP3K) είναι επιτυχείς.
Επιπλέον οι JNK κινάσες σχετίζονται με την αντίσταση στην ινσουλίνη στα άτομα με πρόβλημα παχυσαρκίας. Όποτε κάποια inhibitors θα μπορούσαν να βελτιώσουν αυτήν την δράση.

System Biology


System Biology είναι το διεπιστημονικό εκείνο ερευνητικό πεδίο, το οποίο μελετάει τις βιολογικές διεργασίες σε επίπεδο κυττάρου με μια ολιστική συστημική προσέγγιση. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ βιομορίων που καθορίζουν τις λειτουργίες των κυττάρων και ρυθμίζουν την συμπεριφορά και την αντίδρασή τους στα ερεθίσματα του περιβάλλοντος τους, δημιουργούν μεγάλα και πολύπλοκα δίκτυα μεταφοράς πληροφοριών/σημάτων (πολύπλοκα pathways) και αντίστοιχα μεγάλο όγκο δεδομένων, για την εποπτεία των οποίων δεν φτάνει μια απλή περιγραφή. Η Συστημική Βιολογία χρησιμοποιεί εργαλεία συστημικής ανάλυσης και ανάλυσης σήματος και επικεντρώνεται στην δυναμική συμπεριφορά των διεργασιών αυτών, μοντελοποιώντας τις αλληλεπιδράσεις των βιομορίων και χαρτογραφώντας τα διάφορα δίκτυά τους. Στόχος της είναι η χαρτογράφηση των δικτύων/μονοπατιών των βιομορίων, η ανάλυση και η περιγραφή των λειτουργιών και της οργάνωσης των κυττάρων, για την κατανόηση των φαινομένων και την ανάδειξη των χαρακτηριστικών των διεργασιών. Η Συστημική Βιολογία λειτουργεί βοηθητικά στην Βιολογία, δεν την αντικαθιστά, αλλά ρόλος της είναι να βοηθήσει στην κατανόηση και την περιγραφή των διεργασιών αυτών. Τέλος, με την μοντελοποίηση, μπορεί να βοηθήσει στο σχεδιασμό πειραμάτων, καθορίζοντας τα μεγέθη που πρέπει να μετρηθούν. Χρησιμοποιεί τη μαθηματική μοντελοποίηση των δικτύων/μονοπατιών και ως μεταβλητές ορίζει τις συγκεντρώσεις (μεταβολική ανάλυση) ή ένα μέγεθος "δραστηριότητας" (activity) (ανάλυση σημάτων- signaling networks) και τους ρυθμούς μεταβολής τους. Η μοντελοποίηση αυτή περιγράφει τις χημικές αντιδράσεις και τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των βιομορίων, καταλήγοντας σε ένα σύστημα Συνήθων Διαφορικών Εξισώσεων (ODE), η λύση του οποίου δίνει την απόκριση των μεταβλητών σε κάποιο ερέθισμα συναρτήσει του χρόνου ή του μεγέθους του ερεθίσματος.
Το βάθος της ανάλυσης εξαρτάται από τον τρόπο και το επίπεδο μοντελοποίησης. Ως παράδειγμα δίνονται παρακάτω δύο προτεινόμενα από κάποιους ερευνητές μοντέλα του ERK(MAPk) pathway (Schoeberl and Brightman & Fell models) στα οποία οι διαφοροποιήσεις σε σχέση με την πορεία μετάδοσης του σήματος είναι ευδιάκριτες. Αυτά τα δύο διαφορετικά μοντέλα καταλήγουν σε πολύ διαφορετικά αποτελέσματα (διαγράμματα ενεργοποίησης ERK) (βλ. [5]).


pathway02.png
pathway01.png






Μοντέλα Brightman & Fell (αριστερά), Schoeberl (δεξιά)


Επίσης, εκτός από την συνδεσμολογία, διαφοροποιήσεις μπορεί να υπάρξουν αναφορικά και με το επίπεδο ανάλυσης και μοντελοποίησης, δηλαδή αναφορικά με την απλοποίηση των χημικών αλληλεπιδράσεων. Στα προηγούμενα μοντέλα, αντιπαρατίθεται το παρακάτω διάγραμμα, το οποίο αναπαριστά ένα κομμάτι του ίδιου pathway, το οποίο αναλύει κάθε αλληλεπίδραση/ενεργοποίηση σε δύο χημικές αντιδράσεις, ενώ το μοντέλο του Schoeberl με μια σειρά πολύ περισσότερες από δύο αντιδράσεις.

pathway03.png


Εκτίμηση παραμέτρων του δυναμικου συστήματος μέσω προσέγγισης των πειραματικών δεδομένων

Στη συγκεκριμένη ανάλυση, από το συνολικό MAPK/ERK pathway, επικεντρωνόμαστε στο επιμέρους υποσύστημα μετάδοσης σήματος MEK1(MAPKK1) -> ERK1/2(MAPK) το οποίο φαίνεται στο σχήμα.

pathway.png


Θεωρούμε ότι το σύστημα περιγράφεται απο τη διαφορική εξίσωση

Untitled.png
όπου το διάνυσμα k=[κ1 κ2] είναι οι παράμετροι που θέλουμε να εκτιμήσουμε και η πειραματική κατανομή MEK1(MAPKK) αποτελεί την είσοδο του συστήματος.

Απο τα πειραματικά δεδομένα έχουμε τις χρονικές κατανομές των διαφορων πρωτεινών για διάφορες περιπτώσεις διεγέρσεων. Παρακάτω μπορούμε να δούμε μια συνοπτική γραφική παρουσίαση αυτών των δεδομένων.

experiment.png

Από το σύνολο αυτό παίρνουμε ως δεδομένα επίλυσης τις κατανομές MEK1 ως είσοδο και ERK12 για διεγέρσεις που περιλαμβάνουν το EGF (Epidermal growth factor) δηλαδή συνολικά πέντε διεγέρσεις, τις:
  • EGF
  • INS-EGF
  • EGF-HGF
  • EGF-HGF
  • INS-EGF-HGF
όπου HGF: Hepatocyte growth factor και INS: Insulin.

Στόχος ειναι όπως είπαμε η εύρεση των παραμέτρων της διαφορικής εξίσωσης που περιγράφει το σύστημα. Γι'αυτό το σκοπό θα επιχειρήσουμε μέσω μιας διαδικασίας βελτιστοποίησης να ελαχιστοποιήσουμε τη διαφορά μεταξύ των πειραματικών δεδομένων και των κατανομών που προκύπτουν απο την προσομοίωση. Αυτό θα επιχειρηθεί και για τις 5 διαφορετικές περιπτώσεις διεγέρσεων συγχρόνως.

Η επίλυση γίνεται στο περιβάλλον της Matlab, όπου χρησιμοποιείται για τη βελτιστοποίηση γενετικός αλγόριθμος με αντικειμενική συνάρτηση την :

F=abs(Erk_experimental - Erk_Simulation)

στην συνάρτηση F προστίθενται σε κάθε κύκλο βελτιστοποίησης το σφάλμα πείραμα-προσομοίωση για κάθε διέγερση. Το τελικό διάνυσμα k=[k1 k2] που προκύπτει είναι το:

k=[1.7164 3.3642]

Για αυτή τη λύση τα αντίστοιχα διαγράμματα απόκρισης της υπολογιστικής προσομοίωσης μαζί με τα πειραματικά δεδομένα προκύπτουν:
Numerical_ALL1.png


Numerical_ALL2.png

Numerical_ALL3.png
Numerical_ALL4.png
Numerical_ALL5.png

Παρατηρούμε ότι η απόκριση των πειραματικών δεδομένων μετά τη διέγερση έχει ένα μεγάλο peak στην αρχή που ακολουθείται από ένα δεύτερο προτού αποσβεστεί.

Η υπολογιστική προσομοίωση του συστήματος δεν μας προσφερεί επαρκή προσέγγιση των πειραματικών δεδομένων, ειδικά στο σημείο του δεύτερου peak. Οι λόγοι για αυτό σχετίζονται με το απλουστευμένο μοντέλο του συστήματος που χρησιμοποιήθηκε(2 διαμερίσματα - απαλοιφή εξωτερικών αλληλεπιδράσεων), τον μικρό αριθμό πειραματικών σημείων, την μη εκτίμηση της επίδρασης του θορύβου κ.α.


Βιβλιογραφία -References

  1. Κωνσταντίνα Σπ. Νικήτα, Προσομοίωση Φυσιολογικών Συστημάτων, Θεσσαλονίκη, Εκδ. Τζιόλα, 2010
  2. Birgit Schoeberl, Claudia Eichler-Jonsson, Ernst Dieter Gilles and Gertraud Müller, Computational modeling of the dynamics of the MAP kinase cascade activated by surface and internalized EGF receptors, Nature Biotechnology 20, 370 - 375 (2002)
  3. Bree B. Aldridge, John M. Burke, Douglas A. Lauffenburger and Peter K. Sorger, Physicochemical modelling of cell signalling pathways,Nature CELL BIOLOGY 8, 195-203 (2006)
  4. Baltazar D. Aguda and Herbert M. Sauro, Computer Simulation of MAPK Signal Transduction, Methods in Molecular Biology, vol. 250, 167-175, (2004)
  5. Richard J. ORTON, Oliver E. STURM, Vladislav VYSHEMIRSKY, Muffy CALDER, David R. GILBERT and Walter KOLCH,
    Computational modelling of the receptor-tyrosine-kinase-activated MAPK pathway, Biochem. J. vol 392, 249–261 (2005)

External Links


Wikipedia - Systems Biology
Wikipedia - Mitogen-activated protein kinase
Wikipedia - Serine/threonine-specific protein kinases
Wikipedia - Cell signaling
Wikipedia - MAPK/ERK Pathway
Wikipedia - Cell Signal transduction

MAP Kinase Pathway Video



Εδώ θα βρείτε την παρουσίαση της εργασίας μας, καθώς και τους αλγορίθμους που χρησιμοποιήσαμε για την εργασία μας